Bộ môn Công nghệ Sinh học - Thực phẩm
Tóm tắt
Các loại virus đường ruột, bao gồm virus viêm gan A, Norwalk và Snow Mountain, tác nhân Hawaii và rotavirus đã được phát hiện. Liên quan đến sự bùng phát bệnh do thực phẩm. Các quy trình nuôi cấy cổ điển hiện có sẵn đối với vi rút bại liệt; tuy nhiên, viêm gan A, Norwalk và nhiều loại virus và tác nhân khác không thể nhân lên trong nuôi cấy tế bào, do đó, phương pháp sinh học phân tử các công cụ đã nổi lên như một phương tiện khả thi để phát hiện virus đường ruột trong thực phẩm và các mẫu môi trường. Có những hạn chế tuy nhiên trong việc áp dụng phản ứng chuỗi polymerase và phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược sẽ hạn chế hữu ích trong việc đo lường độ an toàn virus của thực phẩm. Hạn chế nghiêm trọng nhất là các kỹ thuật phân tử không thể phân biệt giữa vi-rút sống và vi-rút bất hoạt mặc dù vi-rút bất hoạt không gây nguy hiểm cho người tiêu dùng và có thể hiện diện ở mức độ cao hơn đáng kể so với các dạng có độc lực. Những nhược điểm khác bao gồm thiếu độ nhạy xét nghiệm và tính đặc hiệu, chi phí xét nghiệm cao và trình độ chuyên môn kỹ thuật không có ở hầu hết các phòng thử nghiệm thực phẩm. Nói chung là khoa học những tiến bộ trong việc phát triển các công cụ sinh học phân tử đã vượt xa việc chứng minh tính hợp lệ của chúng trong việc đánh giá an toàn virus của thực phẩm.
Giới thiệu
Kỹ thuật nuôi cấy cổ điển. Đã có nhiều nỗ lực để phát triển các xét nghiệm tìm virus đường ruột. Những nỗ lực ban đầu có liên quan đến các phân lập lâm sàng. Tuy nhiên công việc đáng kể đã được thực hiện trong việc phát triển được quy trình chiết xuất và xét nghiệm virus đối với virus đường ruột trong thực phẩm và các mẫu môi trường, đặc biệt là từ động vật có vỏ molluscan (7, 8, 22, 35, 46, 54, 61, 73, 81). Các thử nghiệm nhân giống nuôi cấy tế bào luôn sẵn có đối với virus bại liệt, thường được tìm thấy trong môi trường là kết quả sử dụng rộng rãi vắc xin bại liệt uống, giảm độc lực. Những chủng này được thải ra trong phân của những người mới được tiêm chủng trẻ em và có thể hiện diện trong môi trường bị ô nhiễm phân. Có ý kiến cho rằng các chủng vi rút bại liệt trong vắc xin có thể đóng vai trò là dấu hiệu cho sự hiện diện của các vi rút khác vi-rút gây bệnh mà không có quy trình xét nghiệm.
Hình 1: Phương Pháp RT-PCR, M: thang chuẩn, Lane 1-7: mẫu vi khuẩn
Quy trình nhân giống nuôi cấy tế bào, chẳng hạn như xét nghiệm và khả năng gây bệnh tế bào, có thể được sử dụng để liệt kê mức độ của các loại virus bại liệt, adenovirus, và để xác định ở mức độ thấp hơn, rotavirus. Kỹ thuật này không có hiệu quả trong việc phát hiện virus viêm gan A, Norwalk và Snow Mountain virus và các SRSV khác. Các chủng thích nghi đặc biệt Virus viêm gan A có thể được nhân giống và thử nghiệm một cách hiệu quả trong nuôi cấy tế bào và mô; tuy nhiên, những kỹ thuật như vậy là không đủ để định lượng các chủng có nguồn gốc từ lâm sàng, thực phẩm hoặc môi trường. Virus viêm gan A hoang dã có thể được nuôi cấy trong nuôi cấy tế bào, nhưng quá trình này đòi hỏi nhiều ngày hoặc thậm chí vài tuần. Có rất ít hoặc không có thành công trong phát triển hệ thống nuôi cấy tế bào hoặc mô có khả năng thúc đẩy Norwalk và các loại virus liên quan. Theo đó, nhiều nỗ lực phát hiện virus đường ruột đã bị chuyển hướng hướng tới các phương pháp sinh học phân tử
Các phương pháp sinh học phân tử. Trong thập kỷ qua, các công cụ sinh học phân tử đã nổi lên như một công cụ khả thi phương tiện để phát hiện virus đường ruột trong các mẫu lâm sàng, thực phẩm và môi trường. Các mẫu lâm sàng thường có ưu điểm là chứa số lượng lớn các hạt virus. Nỗ lực đang được thực hiện để phát triển các phương pháp tiếp cận mới nhằm xác định sự hiện diện của axit nucleic của virus trong thực phẩm và các mẫu môi trường (được xem xét bởi Romalde). Polymerase Phản ứng dây chuyền (PCR) là một công cụ mạnh mẽ trong phân tử sinh học để khuếch đại DNA trong ống nghiệm.
Việc kết hợp phiên mã ngược (RT) và PCR cho phép khuếch đại RNA bao gồm bộ gen của các virus RNA như bệnh bại liệt, viêm gan A và virus Norwalk. Nhân bản và giải trình tự axit nucleic từ RNA và DNA virus là bước đột phá dẫn đến việc phát triển các mồi đặc hiệu dùng trong khuếch đại RT-PCR của các phân đoạn của các bộ gen virus khác nhau. Các kỹ thuật khác để phát hiện virus bao gồm sử dụng các quy trình thu hồi miễn dịch bằng cách sử dụng chất phủ kháng thể hạt từ tính, PCR phân tách miễn dịch từ tính; PCR ghép kênh RT, PCR lồng nhau và PCR lồng nhau, các mẫu dò gen, và PCR bắt kháng nguyên. Việc phát hiện các sản phẩm PCR và xác nhận tiếp theo bằng cách sử dụng các đầu dò đặc hiệu với virus có thể được sử dụng để xác minh sự hiện diện hay vắng mặt của các chất gây ô nhiễm virus trong các chất chiết xuất từ thực phẩm. Tuy nhiên, có những hạn chế nghiêm trọng trong việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử có thể làm giảm tính hữu dụng của chúng trong việc đo lường độ an toàn về mặt virus học của thực phẩm.
Hình 2: Kỹ thuật phân tích PCR.
Hạn chế của phương pháp sinh học phân tử như các chỉ số về an toàn thực phẩm. Cần có sự đánh giá lại về giá trị của kỹ thuật sinh học phân tử trong việc cung cấp thông tin hữu ích về chất lượng và an toàn thực phẩm và môi trường
Những tiến bộ trong việc phát triển các phương pháp virus học phân tử đã vượt xa việc chứng minh tính hợp lệ của chúng trong việc giám sát môi trường và thực phẩm. Có một số lý do tại sao sinh học phân tử kỹ thuật có thể không phù hợp để đánh giá virus an toàn của thực phẩm. Có lẽ yếu tố quan trọng nhất là sự không chắc chắn về việc liệu các xét nghiệm sinh học phân tử có thể phân biệt được giữa vi rút truyền nhiễm và không truyền nhiễm hay không. Những hạn chế khác bao gồm việc thiếu độ nhạy và độ đặc hiệu như được nêu dưới đây.
Không giống như nhiều loại vi khuẩn gây bệnh có thể phát triển nhanh trong thực phẩm, vi rút đường ruột chỉ đơn thuần là nơi trú ẩn bởi các loại thực phẩm. Sự nhân lên của chúng phụ thuộc vào vật chủ và đặc hiệu, và do đó, các virus đường ruột ở người chỉ hiện diện do ô nhiễm thực phẩm. Điều này thể hiện sự tương phản rõ rệt với những gì gặp phải trong lâm sang mẫu vật nơi virus có thể được làm giàu trong cơ thể con người cơ thể thông qua quá trình sao chép tích cực. Các kỹ thuật sinh học phân tử thích hợp để phát hiện vi rút gây bệnh trong các mẫu bệnh phẩm mà bất kỳ bằng chứng nào về vi rút sẽ biểu thị sự hiện diện của bệnh tật và nơi có thể có, tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng, tính đồng nhất trong hệ thực vật cao hơn trong các mẫu thực phẩm và môi trường. Đó là một tình huống khác, tuy nhiên, khi các phương pháp được phát triển để đo lường sự hiện diện hoặc sự vắng mặt được áp dụng cho thực phẩm. Virus không chỉ được mong đợi có số lượng thấp hơn trong một số thực phẩm nhưng có thể không hoạt động do suy thoái một phần trong quá trình bảo quản hoặc chế biến hoặc vô hiệu hóa bằng nhiều cách khác nhau.
Kết luận
Trong thập kỷ qua, việc tăng cường tài trợ cho các phương pháp dựa trên sinh học phân tử đã dẫn đến sự bùng nổ của các công nghệ mới để theo dõi virus trong nhiều loại ma trận sinh học bao gồm thực phẩm, lâm sàng, và các mẫu môi trường. Tính kém nhạy của các phương pháp, khả năng xảy ra kết quả dương tính giả do ô nhiễm môi trường cũng như kết quả âm tính giả từ chất ức chế, và không có khả năng phân biệt giữa khả thi và các loại virus không lây nhiễm khiến cho tính hữu dụng của những kỹ thuật này trở thành công cụ giám sát thực phẩm bị nghi ngờ. Nỗ lực để phát triển các kỹ thuật nhân giống nuôi cấy tế bào cho bệnh viêm gan Virus A và Norwalk, rotavirus và các loại virus gây bệnh khác đã giảm đi so với những gì có thể nhận thấy những nỗ lực phức tạp hơn, hiện đại hơn về kỹ thuật sinh học phân tử. Tuy nhiên, điểm mấu chốt là là các kỹ thuật phân tử có thể không đủ để phục vụ nhu cầu của cơ quan quản lý. Nỗ lực tài trợ và nghiên cứu nên được chuyển hướng tới sự phát triển của cải tiến phương pháp xét nghiệm và nhân giống nuôi cấy tế bào cũng như để đánh giá tính khả thi của các kỹ thuật phân tử trong các tình huống thực tế. Bởi vì virus đường ruột có thể dễ dàng sinh sôi nảy nở trong tế bào của vật chủ nhạy cảm, có vẻ như với điều kiện thích hợp mức độ thời gian, công sức và kinh phí, các hệ thống tế bào tương tự có thể được phát triển để nhân giống các virus này trong ống nghiệm. Sự phát triển của các công cụ phân tích đơn giản, rẻ tiền và tương đối nhanh chóng để đo lượng virus truyền nhiễm trong thực phẩm là phương tiện thực tế duy nhất mà qua đó các cơ quan quản lý của các cơ quan có thể hy vọng phát triển các chương trình giám sát virus để bảo vệ những người mà họ phục vụ.
Tài liệu tham khảo
1. Atmar, R. L., T. G. Metcalf, F. H. Neill, and M. K. Estes. 1993. Detection of enteric viruses in oysters by using the polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 59:631–635.
2. Atmar, R. L., F. H. Neill, J. L. Romalde, F. Le Guyader, C. W. Woodley, T. G. Metcalf, and M. K. Estes. 1995. Detection of Norwalk virus and hepatitis A virus in shellfish tissues with the PCR. Appl. Environ. Microbiol. 61:3014–3018.
3. Atmar, R. L., F. H. Neill, C. M. Woodley, R. Manger, G. S. Fout, W. Burkhardt, L. Leja, E. R. McGovern, F. Le Guyader, T. G. Metcalf, and M. K. Estes. 1996. Collaborative evaluation of a method for the detection of Norwalk virus in shellfish tissues by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62:254–258.
4. Bean, N. H., P. M. Griffin, J. S. Goulding, and C. B. Ivey. 1990. Foodborne disease outbreaks, 5-year summary, 1982–1987. J. Food Prot. 53:711–728.
5. Beaulieux, F., D. M. See, I. Leparc-Goffart, M. Aymard, and B. Lina. 1997. Use of magnetic beads versus guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform RNA extraction followed by polymerase chain reaction for the rapid, sensitive detection of enterovirus RNA. Res. Virol. 148:11–15
TS. Nguyễn Phúc Thiện (Khoa Kỹ thuật - Công nghệ, Trường Đại học Văn Hiến)