Bộ môn Công nghệ Sinh học - Thực phẩm

1. Các Alkaloid có trong cây Trinh nữ hoàng cung 
Các alkaloid trong họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae) có cấu trúc rất đa dạng và đến nay đã có khoảng 300 alkaloid được phân lập từ các cây thuộc họ này (Bastida và cộng sự, 2011). Các alkaloid được chia thành 12 phân nhóm cấu trúc chính: galanthamine, lycorine, crinine, homolycorine, tazettine, montanine, norbelladine, narciclasine, pancratistatin, nacriprimine, trisphaeridine, ismine (Nair và cộng sự, 2012). Trong các phân nhóm chính đó thì galanthamine, lycorine, crinine là ba phân nhóm chính thường thấy nhất đối với các cây thuộc họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae). 

Hình 1: Các phân nhóm chính của alkaloid thuộc họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae) (Nair và cộng sự, 2012)

 Chi Crinum có khoảng 160 loài được mô tả trong đó chỉ có khoảng 30 loài được nghiên cứu về các thành phần hóa học đặc biệt là alkaloid. Chi Crinum là đại diện thực sự của họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae), cấu trúc của những alkaloid Crinum tuy khác nhau nhưng vẫn nằm trong các phân nhóm chính như crinine (5,10b-ethanophenanthridines), lycorine (pyrrolophenanthridine), tazettine, galanthamine,… (Nguyẫn Thị Ngọc Trâm và cộng sự, 2002).
Từ năm 1983 cho đến nay, các công trình nghiên cứu về Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) đã công bố thành phần hóa học của nó có khoảng 32 loại alkaloid. Trong số đó đáng quan tâm là một số alkaloid có tác dụng kháng u như: crinafolin, crinafolidin, lycorin, và  β -epoxyambellin tác dụng trên tế bào T - lymphocyte và còn có tác dụng kháng khuẩn như hamayne (bulbispenmin, flavonoid, demethylcrinamin). Ngoài alkaloid còn có các hợp chất bay hơi, aldehyde, acid hữu cơ, terpen. Thân rễ có chứa 2 glucan: glucan A có 12 đơn vị glucose, glucan B có 110 gốc glucose. Và một số acid amin: phenylamin, leucin, valin, arginin….
Các công bố trong và ngoài nước về phân lập alkaloid từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) điển hình như:
⦁ Trên thế giới cây Trinh nữ hoàng cung đã được nghiên cứu từ rất lâu, Ghosal (1984) đã phân lập và xác định từ trục phát hoa Trinh nữ hoàng cung một glucoalkaloid có tên là latisolin. Sau đó Ghosal và Shibnath (1984) còn phân lập từ thân hành lúc cây đang ra hoa, pratorimin và pratosin là hai alkaloid pyrolophenathrindon mới cùng với những chất đã được biết như ambelin và lycorin.
⦁ Không dừng ở đó Ghosal (1986) còn công bố đã tách được từ Trinh nữ hoàng cung một số dẫn chất alkaloid có tác dụng chống ung thư Crinafolin và Crinafolidin. Và Ghosal (1989) còn chiết được từ dịch ép trục phát hoa Trinh nữ hoàng cung hai alkaloid mới có nhân pyrrolophennanthridin là 2-epilycorin và 2-epipancrassidin.
⦁ Võ Thị Bạch Huệ và cộng sự (1988) đã phân lập được từ lá cây Trinh nữ hoàng cung 2 alkaloid là crimanidin, 6-hydroxycrinamidine được nhận dạng bằng cách phân tích hóa học và quang phổ.
⦁ Tôn Nữ Quỳnh Như và Võ Bạch Huệ (2000) đã dùng phương pháp acid để định lượng alkaloid từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.).
⦁ Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự (2002) dùng sắc ký khí ghép khối phổ để phân tích các alkaloid có trong lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.): 9-0ctadecenamide, Augustamine, Ambelline, Oxoassoanine, Crinane-3α-ol, Buphanidrine, Powelline, Undulatine, Crinamidine, 1β,2β –Epoxyambelline, 6-Hydroxybuphanidrine, 6-Hydroxypowelline, 6-Hydroxyundulatine, Epoxy-3,7-dimethoxycrinane-11-one, Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine, 6-Hydroxycrinamidine.
⦁ Mai Đình Trị và cộng sự (2004) đã cô lập được phenylpropanoit và flavonol glycosides từ lá tươi cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L).
⦁ Nguyễn Nhật Thành và cộng sự (2010) đã nghiên cứu được trong hoa Trinh nữ hoàng cung có các nhóm chất như triterpenoid, flavonoid, alkaloid, tannin, saponin, chất khử, acid hữu cơ và hợp chất ở hai nhóm triterpenoid và flavonoid tồn tại cả ở dạng tự do và glycoside.
⦁ Solanki và cộng sự (2011) đã nghiên cứu về các thành phần hóa học cũng như dược chất có trong cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.). 
2. Các phương pháp chiết xuất alkaloid (Đái Duy Ban, 2008)
Có hai phương pháp: chiết xuất dưới dạng base và chiết xuất dưới dạng muối.
2.1. Chiết xuất các alkaloid dưới dạng base 
Dược liệu tán nhỏ cho tác dụng với kiềm yếu như NH4OH hay NaHCO3 (nếu sử dụng kiềm mạnh có thể một số alkaloid có cấu tạo este sẽ bị phá hủy). Sau đó chiết bằng dung môi hữu cơ vì hỗn hợp alkaloid dưới dạng base và các tạp chất sẽ tan trong dung môi hữu cơ. Tiếp đến tinh chế các alkaloid bằng cách chuyển các alkaloid base thành muối. Tách muối khỏi dung môi hữu cơ, lúc đó các tạp chất sẽ ở lại trong dung môi hữu cơ. Sau đó chuyển các dạng muối thành dạng base, rồi lại chiết các base bằng dung môi hữu cơ. Cứ tiếp tục như vậy nhiều lần cho đến khi thu được alkaloid base tương đối tinh khiết.
2. 2. Chiết xuất các alkaloid dưới dạng muối 
Dược liệu tán nhỏ cho tác dụng với acid vô cơ hay hữu cơ. Rồi chiết bằng nước hay cồn, lúc này các alkaloid dưới dạng muối và các tạp chất (nhựa, protid, chất đắng,…) sẽ hòa tan trong dịch chiết. Tiếp đến tinh chế các alkaloid, thì trước tiên chuyển chúng thành dạng base bằng cách cho dịch chiết acid tác dụng với kiềm. Rồi dùng các dung môi hữu cơ thích hợp chiết riêng các alkaloid base. Tiếp tục loại các tạp chất bằng cách lắc dung môi hữu cơ với dung dịch acid. Lúc này các alkaloid base lại biến thành muối và các muối này lại tan trong dung dịch nước acid, còn các tạp chất sẽ ở lại trong dung môi hữu cơ. Tách riêng dung dịch nước acid có chứa các muối alkaloid và làm kiềm hóa, rồi lại chiết các alkaloid base bằng dung môi hữu cơ. Cuối cùng cho bốc hơi dung môi hữu cơ ta thu được các alkaloid.
Bên cạnh đó còn có một số phương pháp khác như dùng ethanol để chiết xuất thẳng các alkaloid dưới dạng muối trong cây cỏ. Sau đó bốc hơi ethanol thành cao đặc rồi kiềm hóa để chuyển các alkaloid dạng muối thành các alkaloid dạng base và tiếp tục chiết xuất như các phương pháp trên (Phan Quốc Kinh, 2011).
Như vậy từ các phương pháp trên, thu được một hỗn hợp alkaloid hoặc ở dạng muối hoặc ở dạng base rồi sau đó tiến hành tách riêng từng alkaloid riêng lẽ dựa vào tính chất hóa học, lý học của từng alkaloid. Cũng có thể sử dụng phương sắc ký cột hay phương pháp trao đổi ion.
3. Xác định các thành phần của alkaloid bằng sắc ký lát mỏng (Trần Thị Thu Ngân và cộng sự, 2014)
Alkaloid trong lá và củ được tách chiết theo quy trình của Mai Đình Trị và cộng sự có hiệu chỉnh. Alkaloid được định tính bằng ba loại thuốc thử: Dragendorf, Mayer và Wagner thể hiện qua hiện tượng tủa có màu đặc trưng cho từng loại thuốc thử: thuốc thử Dragendorff sẽ tủa màu đỏ cam, thuốc thử Mayer tủa màu trắng đục và thuốc thử Wagner tủa màu nâu đỏ.Thành phần alkaloid được xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên bản silica gel 60 F254 (Merck millipore, Đức) trong hệ dung môi khai triển chloroform- methanol- amoniac (50:9:1 theo thể tích) với thuốc hiện màu ammonium cerium (VI) sulfate, sấy 100oC trong 30 phút và quan sát dưới tia UV.

Hình 3: Kết quả định tính bằng 3 loại thuốc thử

a. H2SO4 1%
b. Thử bằng thuốc thử Dragendorf
c. Thử bằng thuốc thử Mayer 
d. Thử bằng thuốc thử Wagner
Bằng phương pháp phun thuốc hiện màu SCAP và quan sát dưới tia UV đã xác định được một số alkaloid: vincristine, vinblastine, vidoline và ajmalicine.

Hình 4: Kết quả định tính alkaloid mẫu lá (pH=7,3) bằng sắc ký lớp mỏng và phun thuốc thử hiện màu SCAP

Tài Liệu Tham Khảo
1. Đái Duy Ban, 2008, Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng chống một số bệnh cho người và vật nuôi, NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ.
2. Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng, Phạm thị Nhật Trinh, Nguyễn Công Hào, 2001, Nghiên cứu thành phần Hóa học trong phân đọan không phân cực từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), Tuyển tập các công trình Hội nghị Khoa học và công nghệ Hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ 2, Tr. 366-371.
3. Mai Đình Trị, Nguyễn Công Hào, 2005, Phenylpropanoit và Flavanol glycosides được cô lập từ lá tươi cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), Tạp chí Hóa học, tập 43 (2), Tr. 162-164.
4. Magagula N.L., Mohanlall V. and Odhav B. 2012. Optimized Thin Layer Chromatographic Method for Screening Pharmaceutically Valuable Alkaloids of Catharanthus roseus (Madagascar Periwinkle). International Journal of Sciences.
5. Tôn Nữ Quỳnh Như và Võ Thị Bạch Huệ, 2000, Định lượng alkaloid từ Trinh nữ hoàng cung  (Crinum latifolium L.) bằng phương pháp acid màu, Tạp chí dược liệu, số 2, Tr. 38-42
6. Trần Thị Thu Ngân và cộng sự, 2014, Phân tích tính đa dạng di truyền và thành phần alkaloid của một số cây thuộc họ thủy tiên (amaryllidaceae), Kỷ yếu hội nghị Khoa học lần IX, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM.
ThS. Trần Thị Thu Ngân (Khoa Kỹ thuật - Công nghệ, Trường Đại học Văn Hiến)