Bộ môn Công nghệ Sinh học – Thực phẩm

CRISPR là gì?
CRISPR được viết tắt của những chữ cái đầu của cụm từ Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats [2], được phát hiện lần đầu tiên trong bộ gen của sinh vật nhân sơ vi khuẩn và vi khuẩn cổ năm 1987 (Ishino et al., 1987). Tại thời điểm đó, CRISPR được mô tả là một họ các trình tự DNA ngắn xuôi ngược lặp lại (đọc theo hướng xuôi hay ngược thì đều có trình tự DNA giống nhau) và các trình tự này được ngăn cách với nhau bởi các vùng đệm (spacer). Tuy nhiên các nhà khoa học vẫn chưa biết chức năng của vùng CRISPR này là gì.
Năm 2012, lần đầu tiên công nghệ CRISPR được áp dụng làm kĩ thuật chỉnh sửa hệ gen nhờ công trình nghiên cứu của nhóm tác giả Jennifer Doudna và Emmanuelle Charpentier tại trường đại học California (Jinek et al., 2012). Trong nghiên cứu này nhóm tác giả đã đưa vào trong tế bào một phức hệ bao gồm enzyme Cas9 nuclease và RNA dẫn đường (guide RNA) tự thiết kế để cắt đoạn DNA tại những vị trí mong muốn.

Hình 1. Công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR

Sau đó, hàng loạt các nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật CRISPR đã được tiến hành tạo nên sự bùng nổ về công nghệ CRISPR trong những năm sau tiếp theo. Quá trình chỉnh sửa này có ứng dụng rộng rãi bao gồm nghiên cứu sinh học, phát triển các sản phẩm công nghệ sinh học, và chữa trị các bệnh. Hiện nay rất nhiều tiến bộ trong việc ứng dụng công nghệ CRISPR đã được tìm ra với mục đích cải thiện hệ thống để làm việc hiệu quả hơn, an toàn hơn khi ứng dụng cho việc chữa bệnh trên người.
Phức hệ CRISPR
Năm 2001, Mojica và Ruud Jansen trong khi đang tìm kiếm những đoạn lặp gián đoạn khác, đề xuất cái tên CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) rằng những cụm lặp lại ở sinh vật nhân sơ này đi kèm với một tập hợp các gen tương đồng tạo thành các phức hệ CRISPR hay gen cas. Bốn gen cas (cas 1–4) được nhận diện từ đầu. Các protein Cas chứa motif cấu trúc helicase và nuclease, gợi ý về vai trò trong cấu trúc động của các locus CRISPR [4].

Hình 2. Giản đồ một locus CRISPR

Ba thành phần chính của một vị trí CRISPR được thể hiện gồm: gen cas, một trình tự dẫn đầu, và một mảng lặp-đệm. Các đoạn màu xanh là các đoạn lặp, còn màu đen là đoạn đệm xen giữa. Sự sắp xếp ba thành phần này không phải luôn giống như trong hình. Một số CRISPR với trình tự tương tự nhau có thể xuất hiện trong cùng một bộ gen, nhưng chỉ một trong số đó là có các gen cas.
Một số đoạn đệm CRISPR xuất phát từ DNA thể thực khuẩn và DNA ngoại nhiễm sắc thể như là plasmid. Nói cách khác, các đoạn đệm (spacer) là những đoạn DNA lấy từ những virus từng cố gắng xâm nhập tế bào trước đó. Nguồn gốc của các đoạn đệm là dấu hiệu cho thấy phức hệ CRISPR/cas có thể đóng một vai trò trong hệ miễn dịch thu được ở vi khuẩn.
Các thí nghiệm của nhiều nhóm khác nhau cho thấy cơ chế cơ bản của miễn dịch CRISPR-Cas. CRISPR là một hệ miễn dịch thu được được đăng tải. Một vùng CRISPR trong Streptococcus thermophilus lấy đoạn đệm từ DNA của một thể thực khuẩn xâm nhập. Năm 2008, Brouns và Van der Oost tìm ra một phức hệ các protein Cas (gọi là Cascade) trong E. coli cắt tiền RNA CRISPR trong những đoạn lặp thành những phân tử RNA trưởng thành chứa đoạn đệm gọi là RNA CRISPR (crRNA), gắn với phức hệ protein. Các nhà nghiên cứu phát hiện rằng cần có Cascade, crRNA và một helicase/nuclease (Cas3) để giúp vi khuẩn miễn dịch với một virus DNA. 
⦁ Cas9: Các nhà nghiên cứu tập trung vào một hệ CRISPR đơn giản trong Streptococcus pyogenes dựa vào protein Cas9. Endonuclease Cas9 là một phức hệ bốn phần gồm hai phân tử crRNA nhỏ và RNA CRISPR chuyển hoạt (tracrRNA) [5]. Bằng cách điều khiển chuỗi nucleotide của RNA dẫn đường, phức hệ Cas9 nhân tạo có thể được lập trình để đánh vào bất kỳ chuỗi DNA nào xâm nhập. Cas9 từ hệ CRISPR của S. thermophilus có thể được tái lập trình để nhắm vào mục tiêu tùy ý bằng cách thay đổi trình tự của crRNA. Những bước tiến này thúc đẩy các nỗ lực chỉnh sửa bộ gen bằng hệ thống CRISPR-Cas9 tùy biến.
⦁ Cas12a: nuclease Cas12a được miêu tả trong phức hệ CRISPR/Cpf1 của vi khuẩn Francisella novicida. Sự phổ biến loại CRISPR- Cas này ở chi Prevotella và Francisella [6]. Cas12a khác với Cas9 ở một số điểm bao gồm: gây ra vết cắt 'so le' trong đoạn DNA kép thay vì vết cắt 'thẳng' như của Cas9, dựa trên một trình tự PAM giàu thymine và chỉ cần một RNA CRISPR (crRNA) để tìm thấy mục tiêu, trong khi Cas9 cần cả crRNA và một crRNA chuyển hoạt (tracrRNA). Sự khác nhau này có thể khiến Cas12a tốt hơn Cas9 ở một số mặt. Ví dụ, các crRNA nhỏ của Cas12a phù hợp cho chỉnh sửa gen phức tạp, do số lượng crRNA sử dụng được lớn hơn snRNA của Cas9. 
⦁ Cas13: nuclease Cas13a ở vi khuẩn Leptotrichia shahii được miêu tả. Cas13 là một endonuclease RNA do RNA dẫn đường, nghĩa là nó không nhắm vào DNA mà chỉ cắt RNA [7]. Cas13 được dẫn đường bởi crRNA của nó tới mục tiêu ssRNA và bám vào rồi cắt mục tiêu. Một tính chất đặc trưng của Cas13 so với Cas9 là sau khi cắt, Cas13 vẫn bám vào mục tiêu rồi cắt những phân tử ssRNA khác. Tính chất này được gọi là "collateral cleavage" và đã được sử dụng để phát triển một số công nghệ chẩn đoán.
Quy trình sửa gen của CRISPR
⦁ Bước “tìm bạn”: bộ mã RNA tìm và bắt cặp với một đoạn DNA cần sửa.
⦁ Bước cắt bỏ đoạn lỗi: Men cas cắt bỏ đoạn lỗi trong DNA cần sửa.
⦁ Bước chèn ghép đoạn DNA mẫu: CRISPR chèn đoạn DNA thay thế đoạn lỗi đã bị cắt đi.

Hình 2. Phức bộ công cụ sửa gen CRISPR.

Hình 3. CRISPR tìm để “bắt cặp” với đoạn gen cần sửa.

Hình 4. Phần RNA bắt cặp với một đoạn gen cần sửa

Hình 5. Protein Cas cắt đoạn gen “lỗi” ra khỏi chuỗi DNA cần sửa

Hình 6. CRISPR đưa đoạn DNA “xịn” lấp vào chỗ DNA “lỗi” đã bị cắt đi.

CRISPR/Cas9 là hệ thống được mô tả lần đầu tiên và được dùng phổ biến [8]. Hệ thống CRISPR/Cas9 bao gồm 2 thành phần: enzyme Cas9 nuclease và RNA dẫn đường. Nhờ đoạn trình tự bổ sung của RNA dẫn đường với trình tự đích mà phức hợp này có thể tìm thấy vị trí cần chỉnh sửa trên hệ gen. Để có thể hoạt động, hệ thống CRISPR còn yêu cầu một trình tự ngắn từ 2-5 nucleotides trên DNA đích được gọi là protospacer associated motif (PAM) ngay sau đoạn bổ sung của RNA dẫn đường (đối với CRISPR/Cas9 của vi khuẩn S.pyogenes thì trình tự này là 5’-NGG, trong đó N là bất kỳ nucleotide nào). Khi phức hợp Cas9 và guide RNA bám vào trình tự đích, enzyme Cas9 sẽ dùng 2 tiểu phần HNH và RuVC của mình để cắt đoạn DNA trên cả 2 mạch tại vị trí nucleotide thứ 3-4 phía trước PAM.
Theo cơ chế tự sửa chữa của tế bào, đoạn DNA sau khi bị cắt sẽ được hàn gắn lại theo 2 con đường: con đường ghép nối không tương đồng (non-homologous end joing NHEJ và con đường sửa chữa tái tổ hợp tương đồng (homology directed repair – HDR). Con đường sửa chữa NHEJ sẽ tạo ra các đột biến mất hoặc mất nucleotide, trong khi con đường sửa chữa HDR sử dụng khuôn mẫu có trình tự tương đồng ở khớp nối nên bảo toàn được trình tự DNA. Thông qua cơ chế cắt và nối DNA này các nhà khoa học có thể thêm, xoá, thay đổi trình tự DNA trong hệ gen. Công cụ CRISPR được ví như một chiếc “kéo sinh học” giúp các nhà khoa học có thể dung làm “phẫu thuật phân tử” nhờ khả năng cắt một cách chính xác tại vị trí mong muốn và từ đó giúp chỉnh sửa hệ gen trong tế.
CRISPR ứng dụng như thế nào? [1][9]
CRISPR khác các công cụ sửa gen thế hệ cũ ở đặc điểm cơ bản là các công cụ sửa gen thế hệ cũ chỉ có thể ức chế hoạt động của gen bị sửa, còn CRISPR có cả khả năng đó và thêm khả năng có thể tăng cường hoạt động của gen được sửa.
CRISPR còn được dùng để hiểu quá trình một tế bào lành biến thành tế bào ung thư, tế bào ung thư tiến hóa để lẫn tránh hệ miễn dịch, kháng lại các biện pháp điều trị. CRISPR có thể giúp tìm và khóa gen trong tế bào ung thư tham gia cơ chế kháng thuốc, hoặc tăng nhạy cảm của tế bào ung thư với thuốc.
Sử dụng CRISPR để vô hiệu hoá những gen ở cây bắp và lúa để cải thiện năng suất cây trồng. Đầu tiên cần lập bản đồ bộ gen của cây bắp và lúa, hai trong số những cây lương thực lớn nhất toàn cầu, sau đó tìm kiếm bộ gen của chúng để tìm các gen liên quan đến năng suất hạt. Đã tìm ra 490 cặp gen có chức năng giống nhau ở cả hai loài thực vật và thu hẹp các gen chỉ còn hai - một gen từ cây bắp và một gen từ lúa. Cả hai đều tạo ra một loại protein quy định số lượng hạt mà một loại cây nhất định có thể tạo ra. Sau đó, sử dụng kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR để tắt hai gen này. Sau đó, trồng thử nghiệm bằng cách sử dụng hạt giống có các gen đã chỉnh sửa và đo năng suất trung bình. Khi xem xét năng suất, các nhà nghiên cứu nhận thấy những cây có gen biến đổi tạo ra nhiều hạt hơn so với các nhóm đối chứng, năng suất bắp tăng 10% và lúa 8%. Họ cũng nghiên cứu các cây biến đổi gen để xem liệu có thể phát hiện ra bất kỳ thay đổi nào khác, đặc biệt là những thay đổi có thể gây ra tác động tiêu cực đến sự phát triển của cây trồng và kết quả là không tìm thấy. Kỹ thuật này cung cấp một cách tiếp cận hợp lý để tăng năng suất cây trồng và các cây biến đổi có thể được trộn với các giống hoang dã để tạo ra các loài mới có khả năng chống chịu tốt hơn với biến đổi khí hậu.
Tài liệu tham khảo: 
1. Cinà, D.P., Phillips, D. & Flannigan, R. CRISPR/Cas9 in Male Factor Infertility. Curr. Tissue Microenviron. Rep. 1, 89–97 (2020). 
2. Barrangou R (2015). “The roles of CRISPR-Cas systems in adaptive immunity and beyond”. Current Opinion in Immunology. 32: 36–41.
3. Redman M, et al (2016). 3. “What is CRISPR/Cas9?”. Archives of Disease in Childhood. Education and Practice Edition. 101 (4): 213–5.
4. Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (tháng 3 năm 2002). “Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes”. Molecular Microbiology. 43 (6): 1565–1575.
5. Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao Y, Pirzada ZA, Eckert MR, Vogel J, Charpentier E (2011). 5. “CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III”. Nature. 471 (7340): 602–607.
6. Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, 6. Zhang F (2015). 6. “Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system”. Cell. 163 (3): 759–771.
7. Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, và đồng nghiệp (2016). 7. “C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector”. Science. 353 (6299): aaf5573.
8. Travis J (2015). 8. “Breakthrough of the Year: CRISPR makes the cut”. Science Magazine. American Association for the Advancement of Science.
9. https://cesti.gov.vn/
ThS. Huỳnh Đặng Hà Uyên (Khoa Kỹ thuật - Công nghệ, Trường Đại học Văn Hiến)