Bộ môn Công nghệ Sinh học – Thực phẩm

Chitosan là một polysacaride mạch thẳng được cấu tạo từ các D-glucosamine (đơn vị đã deaxetyl hóa) và N-acetyl-D-Glucosamine (đơn vị chứa nhóm acetyl) liên kết tại vị trí β-(1-4). Nó được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các loài giáp xác (ví dụ vỏ tôm, cua) với dung dịch kiềm NaOH [4].
Chitosan có nhiều ứng dụng trong thương mại và y sinh. Nó có thể được dùng trong nông nghiệp với vai trò xử lý hạt giống và thuốc trừ dịch hại sinh học, giúp cây trồng chống lại các loại bệnh do nấm. Ngoài ra, chitosan còn tăng cường miễn dịch của cơ thể với các tác dụng kích thích sản sinh bạch cầu, giảm cholesterol trong máu, hạn chế sự phát triển của khối u, có tác dụng tốt trên các vết thương, vết bỏng,... [3].
Ở Việt Nam, chitosan và các chế phẩm từ chitosan đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp, với những đặt tính sinh học được nhiều kết quả nghiên cứu minh chứng như: khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa, hấp phụ, giải hấp phụ,... và an toàn với người sử dụng [3].
GIỚI THIỆU VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN [2]
Phát hiện Chitosan bắt nguồn từ năm 1811 bởi Henri  Braconnot – Giám đốc Vườn thực vật tại Viện hàn lâm Khoa học (Botanical  Gardens at the Academy of Sciences) ở Nancy, Pháp. Ông đã xác định được một chất chiết xuất từ nấm sẽ hòa tan trong axit sunfuric và đặt tên là “fungine”. Sau đó được đổi tên thành “Chitin” sau vài năm, đến 1823 một khoa học gia người Pháp Auguste Odier đã phân lập được nó từ lớp biểu bì của bọ cánh cứng và đặt tên theo tiếng Hy Lạp “tunic”, “chiton”. Chitin là polysacaride đầu tiên được xác định bởi con người, trước cellulose khoảng 30 năm. Chitin là poly [b- (1-4) -N-acetyl-D-glucosamine, polymer phổ biến nhất sau cellulose. Dẫn xuất quan trọng nhất của chitin là chitosan, nó là một chuỗi dài tuyến tính (thẳng) ngẫu nhiên của các đơn vị N-acetyl-D-glucosamine (đơn vị acetyl hóa) và D-glucosamine (đơn vị khử acetyl) được nối bởi các liên kết b- (1-4). Thông thường, sự khác biệt giữa chitin và chitosan dựa trên mức độ acetyl hóa (DA), với chitin có giá trị DA cao hơn 50% và chitosan có tỷ lệ phần trăm thấp hơn.

(a)

(b)
Hình 1. Cấu trúc phân tử chitin (a), chitosan (b) [5]

Chitin và chitosan là các polyme tương thích sinh học, phân hủy sinh học và không độc hại. Nó có tiềm năng to lớn chưa được khám phá và có thể giúp biến nông nghiệp bền vững thành hiện thực. Chitosan gây ra sự hình thành callose, hoạt động như chất ức chế proteinase và giúp sinh tổng hợp phytoalexines. Sử dụng chitosan trên lá giúp tăng độ dẫn của khí khổng và giảm thoát hơi nước, không ảnh hưởng đến chiều cao cây và chiều dài rễ, diện tích lá hoặc sinh khối thực vật. Phun chitosan trên lá làm tăng lượng axit abscisic (ABA). Chitosan có thể được sử dụng làm vật liệu phủ hạt cho ngũ cốc, các loại hạt, trái cây và rau quả. Nó làm thay đổi tính thấm của màng sinh chất trong hạt giống, làm tăng nồng độ đường và proline, tăng cường hoạt động peroxidase (POD), catalase (CAT), phenylalanine ammonia-lyase (PAL) và tyrosine ammonia-lyase (TAL). Nó hoạt động như thuốc chống nấm, kháng virus và tác nhân sinh học, chitosan đóng vai trò quan trọng là chất mang cho phân bón giải phóng chậm. Cải thiện khả năng giữ nước của đất và khả năng chelate kim loại nặng tốt nhất, kiểm soát ô nhiễm tảo trong hồ và hoạt động như một chất điều hòa cho đất.
SẢN XUẤT VÀ TÍNH CHẤT [1]
Chitosan được sản xuất trong công nghiệp bằng phương pháp deacetyl hóa chitin, vốn là chất tạo nên cấu trúc của lớp vỏ của các loài giáp xác và thành tế bào của loài nấm. Độ deacetyl hóa (%DD) có thể được xác định bằng phương pháp đo phổ NMR, %DD của chitosan thương mại thường dao động trong khoảng từ 60 đến 100%. Nhìn chung, phân tử lượng của chitosan thương mại nằm trong khoảng 3.800 – 20.000 Daltons. Phương pháp deacetyl hóa chitosan thông dụng là sử dụng lượng dư dung dịch NaOH. Phương pháp này cho phép thu được sản phẩm có %DD cao đến 98%.

Hình 2. Deacetyl hóa chitin [1].

Theo Sukmark và cs (2011) chitosan có độ deacetyl trên 95% cho hiệu quả kháng khuẩn tốt đối với cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương (E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis), chitosan có khối lượng phân tử từ 50-80 kDa cho kháng khuẩn tốt nhất. Serano (2000) và Samar (2013) cho thấy rằng chitosan tác động kháng khuẩn lớn khi trọng lượng phân tử thấp (Mw). Một nghiên cứu khác đã chứng minh rằng hiệu quả kháng khuẩn trên E. coli giảm khi Mw của chitosan tăng [1]. Hơn nữa, nó chỉ ra rằng Mw tối ưu của chitosan để kháng vi sinh là 1,5 kDa. Từ đó cho thấy hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ deacetyl và khối lượng phân tử của chitosan.
MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CHITOSAN TRONG NÔNG NGHIỆP [1]
1. Cơ chế bảo vệ thực vật
Thực vật phản ứng tự nhiên chống lại tình trạng stress sinh học và môi trường, nhưng đôi khi cần phải phòng thủ chống lại các mối đe dọa khó khăn hơn. Chitosan là một polymer tuyệt vời cảm ứng gây ra các hành động phòng thủ và phản ứng chống lại sự tấn công của mầm bệnh. Phytoalexines và protein liên quan đến sinh bệnh học (PR), chất ức chế protein, chitinase, glucanase, sự mất cân bằng giữa các gốc tự do oxy hóa (Reactive Oxygen  Species - ROS) và sinh ra hydroperoxid được ưu tiên khi có chitosan. Chitosan tương tác với DNA tế bào tạo ra nhiều phản ứng sinh hóa trong cây, phản ứng nhanh trong cây chống lại sự tấn công của mầm bệnh, do đó được coi là một elicitor, (một chất kích hoạt cơ chế bảo vệ trong thực vật). Phản ứng của thực vật khi bắt đầu stress do nhiễm mầm bệnh được coi là một dấu hiệu của sự kháng thuốc. Nồng độ chitosan ở mức 2-4 g / lít dẫn đến tác động tích cực đến hàm lượng hormone nội sinh, hoạt động alpha-amylase và hàm lượng chất diệp lục trong lá cây ngô. Chitosan tăng, hoạt động chitinase và chitosanase trong cây củ nghệ giúp tăng cường sức đề kháng chống lại nhiễm trùng Pythium aphanidermatum. Chitosan gây ra sự hình thành callose trong tế bào đậu tương và rau mùi tây, chất ức chế proteinase trong lá cà chua và sinh tổng hợp phytoalexines trong hạt đậu. Hoạt tính elicitor của chitosan dường như được trung gian thông qua sự tương tác của phân tử polycationic này với phospholipid tích điện âm, thay vì tương tác cụ thể với một phân tử giống như thụ thể.
2. Thúc đẩy tăng trưởng thực vật và chống lại stress phi sinh học
Chitosan đóng vai trò là chất thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở một số cây trồng như cây đậu Faba, củ cải, chanh dây, khoai tây, hoa đồng tiền, cải bắp, đậu tương và các loại cây trồng khác. Nó làm tăng sản xuất thực vật và bảo vệ cây chống lại mầm bệnh. Chitosan có ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ tăng trưởng của rễ, chồi, ra hoa và số lượng hoa. Các phân tử này ưa nước và làm giảm stress trong tế bào thực vật bằng cách giảm thế nước và tăng hoạt động của một số phân tử vĩ mô sinh học. Sự tăng trưởng của hoa lan (Dendrobium và Cymbidium tương ứng) được tăng cường khi chitosan được cung cấp cho các cây được nhân giống phát triển trong điều kiện vô trùng. Những cải thiện đáng kể về tăng trưởng đã được báo cáo ở củ cải daikon (Raphanussativus), mầm đậu nành, bắp cải (Brassica oleracea), húng quế ngọt. Chitosan tăng cường sự phát triển của cây lúa thông qua mạng lưới biểu hiện gen giữa nhân và lục lạp. Sự kết hợp của chitosan và rhizobacteria thúc đẩy tăng trưởng thực vật có thể được sử dụng làm phân bón sinh học để cải thiện sản xuất ngô. Nó được sử dụng như một chất kích thích sinh học trong việc trồng lan Nam Phi trong chậu. Và tăng cường mức độ phytochemical, hoạt động enzyme và chống oxy hóa của lá rau bina bằng cách xử lý chitosan. Chitosan dựa trên siêu hấp thu làm chậm héo cây cỏ linh lăng sau 6-10 ngày giúp cải thiện tính trạng chịu stress của cây.

Hình 3. Chitosan đặc biệt có tác dụng tốt với hoa lan giúp kích thích sự tăng trưởng và phát triển của hoa lan, đặc biệt là dòng lan cảnh Nam Phi (Dendrobium và Cymbidium) [1].

3. Kháng độc
Ứng dụng trên lá Chitosan làm tăng độ dẫn của khí khổng và giảm thoát hơi nước, không ảnh hưởng đến chiều cao cây, chiều dài rễ, diện tích lá hoặc sinh khối thực vật. Khi chitosan được phun trong lá, hàm lượng axit abscisic (ABA) sẽ tăng khả năng kiểm soát việc mở khí khổng. Sử dụng nước của cây hồ tiêu được xử lý bằng chitosan giảm 26% 43%, chitosan có khả năng được phát triển như một chất chống bốc hơi trong các tình huống nông nghiệp khi mất nước quá mức là không mong muốn. Cả ABA và axit jasmonic đều được tìm thấy tăng nồng độ để đáp ứng với xử lý bằng chitosan và các hormone này có liên quan đến việc kiểm soát mở khẩu độ lỗ khí.
4. Phủ hạt
Chitosan có thể được sử dụng làm vật liệu phủ hạt cho ngũ cốc, các loại hạt, trái cây và rau quả. Nó làm thay đổi tính thấm của màng plasma hạt giống, làm tăng nồng độ đường và proline, và tăng cường peroxidise (POD), catalase (CAT), phenylalanine ammonia-lyase (PAL) và tyrosine ammonia-lyase (TAL). Tỷ lệ nảy mầm của hạt tăng đáng kể và cây con nảy mầm nhanh hơn, tốt hơn và có sức sống mạnh mẽ. Hạt được ngâm với chitosan đã làm tăng năng lượng nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm, hoạt động lipase và axit gibberellic (GA3) và nồng độ axit axetic indole (IAA) trong đậu phộng. Hạt giống trong ngô làm tăng khả năng chịu lạnh. Việc lót bằng chitosan làm giảm tính thấm tương đối của màng plasma của ngô dưới nhiệt độ thấp dẫn đến ít thiệt hại hơn do áp suất nhiệt độ thấp. Sự suy giảm của malon dialdehyd (MDA) là một chỉ số của lipid mỗi quá trình oxy hóa cũng được gây ra bởi lớp phủ chitosan do tăng hoạt động chống oxy hóa.

Hình 4. Lúa giống được xử lý Chitosan hàm lượng 0.2-0.5% kích thích nảy mầm rất mạnh, cây lúa non sinh trưởng rất khoẻ, kháng được nhiều bệnh [3]. 

5. Kháng nấm
Chitosan ức chế sự phát triển xuyên tâm và ngập nước của Alternaria solani ở mức 1 mg / ml và kiểm soát cây cà chua khỏi mầm bệnh bạc lá. Cải thiện đất với chitosan đã nhiều lần được chứng minh là kiểm soát các bệnh nấm trong nhiều loại cây trồng, đặc biệt là héo Fusarium và nấm mốc xám. Việc kiểm soát mầm bệnh oomycete cũng đã đạt được khi điều trị bằng chitosan, với Phytophthora capsici trên ớt và Phytophthora infestans trong khoai tây, sự kiểm soát của Phytophthora capsici trong ớt là do sự gián đoạn của hệ thống gây ra bởi chitosan. Nó kiểm soát bệnh Alternaria blight ở cà chua, giảm dần và ức chế sự phát triển của Fusarium oxysporum f. sp. Tracheiphilum gây ra thay đổi hình thái.

Hình 5. Vết bệnh thối nhũn được kiểm soát bằng chế phẩm chitosan [4].

6. Tác nhân chống virus
Chitosan đã được chứng minh là kiểm soát các bệnh do virus ở thực vật. Tuy nhiên, vẫn chưa xác nhận rằng virus bị bất hoạt trực tiếp bởi chitosan, điều này dường như không thể xảy ra vì virus không bao gồm chitin hoặc các polysacaride liên quan. Do đó, thay vì độc tính trực tiếp, người ta đã đề xuất rằng chitosan có hiệu quả chống lại virut thực vật bằng cách sửa đổi phản ứng của loài thực vật đối với nhiễm trùng. Phản ứng quá mẫn được phát triển trong việc kiểm tra hạt chuyển virus bằng ứng dụng chitosan, cũng báo cáo các quan sát tương tự với virus khoai tây X, virus khảm thuốc lá và virus hoại tử, virus khảm alfalfa, virus stunt đậu phộng và virus khảm dưa chuột.
7. Thuốc sinh học
Chitosan, được áp dụng trong đất thúc đẩy các vi sinh vật chitinolytic phá hủy trứng tuyến trùng và làm thoái hóa lớp chitin chứa lớp biểu bì của tuyến trùng non. Do hàm lượng nitơ cao trong chitosan, nồng độ khí thải amoniac làm tăng độc tính đối với tuyến trùng. Chitosan thể hiện hoạt động elicitor bằng cách tạo ra các cơ chế kháng thuốc tại chỗ và toàn thân của cây cà chua chống lại tuyến trùng nút thắt Meloidogyne incognita. Chitosan trọng lượng phân tử thấp kiểm soát M incognita theo cách tốt hơn. Tuyến trùng gỗ thông (Bursaphelen chusxylophilus) một tuyến trùng thân được kiểm soát bởi chitosan vì nó gây ra sự thay đổi trong cộng đồng vi khuẩn hỗ trợ tuyến trùng phát triển, tức là gram âm đối với vi khuẩn gram dương làm thay đổi khả năng sinh sản của nó. Chitosan tăng cường khả năng gây bệnh của trứng Meloidogyne javanica bởi nấm tuyến trùng Pochonia chlamydosporia làm tăng sự phân biệt appressorium ở Pochonia chlamydosporia.
8. Xử lý sau thu hoạch
Lớp phủ Chitosan có khả năng thay đổi không khí bên trong mô và tính chất chống nấm có khả năng kéo dài tuổi thọ bảo quản và kiểm soát sâu răng của trái cây. Trong trái cây và rau quả, chitosan cung cấp độ cứng hơn và nó thúc đẩy giảm điện tích vi sinh thông thường. Làm tăng tuổi thọ sản phẩm. Lớp phủ chitosan có khả năng thay đổi không khí bên trong mà không gây ra hô hấp kị khí, vì màng chitosan dễ thấm qua O2 hơn so với CO2. Hiệu quả trong việc duy trì màu trái cây, cho thấy quá trình chín giảm và thời gian lưu trữ kéo dài của xoài. Kiểm soát sự thối hỏng sau thu hoạch trên quả cà chua Cherry có thể thông qua con đường truyền tín hiệu Kinase Protein hoạt hóa Mitogen.

Hình 6. Khả năng kháng bệnh thán thư do nấm Collectotrium spp. gây trên xoài sau thu hoạch ở điều kiện in vivo [4].

Tài liệu tham khảo
1. Chitosan in Agricultural Context-A Review, 2018.
2. Chitosan in Plant Protection, 2010.
3. https://vast.gov.vn.
4. https://sokhcn.binhduong.gov.vn.
5. https://sciencevietnam.com.